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双空间平台强强联用系列文章之一研究人员如何及何时使用和
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08-15
【科技】
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摘要我们最近讨论了Visium空间基因表达平台和Xenium原位空间转录组学平台的主要特点，包括多重性、灵敏度和分辨率等技术方面的考量（请参考往期文章：【突破空间组学研究极限】VisiumHD与XeniumInSitu的完美融合）。您可以根据这些信息来考虑哪个平台最适合您当前的应用，或者是否应该同时使用这两个平台。正如“一图胜千言”，其他人如何做出这一决策的真实案例也很有帮助。那么，其他科学家如何利用这些空间转录组学工具来解决他们的生物学问题呢？Visium和Xenium的哪些优势助力每项研究获得更
我们最近讨论了Visium空间基因表达平台和Xenium原位空间转录组学平台的主要特点，包括多重性、灵敏度和分辨率等技术方面的考量（请参考往期文章：【突破空间组学研究极限】VisiumHD与XeniumInSitu的完美融合）。您可以根据这些信息来考虑哪个平台最适合您当前的应用，或者是否应该同时使用这两个平台。
正如“一图胜千言”，其他人如何做出这一决策的真实案例也很有帮助。那么，其他科学家如何利用这些空间转录组学工具来解决他们的生物学问题呢？Visium和Xenium的哪些优势助力每项研究获得更多见解？其他科学家如何利用一种技术的见解为另一种技术的实验提供信息？
在本系列文章中，我们将重点介绍一些文献和预印本来帮助您回答这些问题。这些文献使用Visium和Xenium来研究同一种生物系统，但研究的角度和目标却各不相同。
主要内容摘要
绘制人类肺癌早期阶段的肿瘤-免疫组成
利用Visium分析来无偏绘制肿瘤微环境中的免疫细胞类型，并获得基因表达特征与肿瘤形态之间的关联。
Xenium分析通过高空间分辨率梳理出局部巨噬细胞亚型的差异，进一步揭示了异质性肿瘤微环境中的单细胞生物学特征。
确定小鼠丘脑的细胞-分子结构
结合使用Visium分析与单细胞RNA测序（scRNA-seq），以区分小鼠丘脑前核（ANT）三个亚区的兴奋性神经元簇，并揭示了沿着前腹侧（AV）亚区的背内侧-腹外侧轴的空间基因表达异质性模式。
Xenium分析提供了同一个组织区域的高分辨率视图，进一步理清了细胞异质性，揭示了AV该群特有的星形胶质细胞-兴奋性神经元混合细胞类型，并确认了ANT内基因表达异质性的空间带状分布。
从原位癌到浸润性肺癌
癌症是微观世界中的进化。突变使得癌症更有可能在生物学和肿瘤微环境的双重选择性压力下存活，并不断积累和增殖。只不过，这个过程带来的不是无数最美丽的形式，而是大量的进化优势，双空间平台强强联用系列文章之一研究人员如何及何时使用和使癌细胞能够躲避我们的免疫系统，抵抗细胞凋亡的指令，不受控制地分裂，并转化为多种不同类型的癌症，包括更具侵袭性也更棘手的晚期疾病。
在最近的一篇论文中，东京大学Suzuki实验室试图表征肺原位腺癌（AIS）和几种不同的AIS亚型（NoguchiA、B和C型），这些亚型代表了非侵袭性的疾病早期阶段，手术切除肿瘤后患者的存活率很高(1)。研究人员的目的是更好地了解驱动危险性较低的原位亚型发展为浸润性肺腺癌分子事件。然而，这些进化轨迹的确定在很大程度上依赖于对细胞类型的交叉、肿瘤微环境中的线索以及组织空间背景的了解。
各个肺癌亚型的转录组分析揭示出可能驱动疾病进展的免疫细胞特征
研究团队对冷冻组织样本进行批量细胞RNA-seq和基因本体分析，以区分NoguchiA型和B型AIS。他们发现，每种亚型表现出不同的特征。A型病例的细胞生长和存活相关基因表现出失调。相比之下，B型病例则显示出免疫相关基因的广泛上调和细胞毒性淋巴细胞的增加。
研究团队随后采用Visium空间基因表达分析来验证这些转录组分析结果，并定位了B型肿瘤微环境中的免疫细胞类型。在一张NoguchiB型肿瘤切片中，他们对Visium数据进行单细胞解卷积，发现了高水平表达FABP4和SPP1的巨噬细胞亚型，它们堆积在肺泡塌陷区域（急性肺部损伤部位）附近。对SPP1 巨噬细胞的配体-受体相互作用的分析表明，这些细胞正在影响局部的成纤维细胞，并可能导致肺泡塌陷和纤维灶的形成，而纤维灶是已知的NoguchiB型AIS的组织病理学指标。这些组织病理学事件也可能成为一些诱因，导致AIS变得更具侵袭性。
为了进一步提升空间转录组分析，并以真正的单细胞视角查看这些AIS阶段的免疫细胞活性，研究人员采用Xenium原位分析，以高的空间分辨率证实了他们的结果。在对一个A型和一个B型病例进行分析后，Xenium帮助他们靶向两个样本间40多万个细胞中的302个基因。值得注意的是，他们能直接观察到SPP1 和FABP4 巨噬细胞定位在B型肿瘤的肺泡结构中，而不是A型。在放大B型肿瘤切片的一小块区域后，他们还观察到局部巨噬细胞群存在M1促炎表型和M2抗炎表型之间的极化，这可能与肿瘤微环境中受区域影响的抗肿瘤或免疫抑制功能有关(2)。随后，研究团队利用Xenium数据对Visium数据进行解卷积，进一步完善了Xenium基因组合和全转录组Visium数据中共有基因的细胞类型分配。
Visium和Xenium在AIS亚型上的共同应用（图1、2）清晰地描绘出这些肿瘤类别之间细胞组成的差异，并有助于从机制上了解免疫细胞介导的过程，这些过程可能会驱动AIS发展到更具侵袭性的阶段。此外，这项研究还强调了能够利用Visium分析收集全转录组信息，以发现基因表达特征与肿瘤形态之间的关联，然后利用靶向的Xenium分析来揭开异质性肿瘤微环境中存在的单细胞生物学特征。
图1
(e)三个代表性病例（TSU-20、TSU-21和TSU-33）的Visium空间转录组分析。
图中显示了分化良好的肿瘤细胞（NAPSA）和肺泡巨噬细胞（MARCO）中的标志物基因表达模式。
(f)Visium数据中转录组特征基因在相应组织学类型中的富集评分。
(h)Visium数据中肿瘤细胞标志物的空间表达模式。
图片改编自Hagaetal.2023中的图6。(CCBY4.0).
图2
利用Xenium原位分析对病例TSU-21进行单细胞空间分析。
(i)Xenium鉴定出的细胞簇空间分布（左图）和UMAP（右图）。
(j)肺泡巨噬细胞标志物MARCO的Xenium空间表达模式（左图）。
一些巨噬细胞标志物在局部区域的表达模式（中图和右图）。
每个点代表一个检测到的RNA分子。
丘脑是大脑的信息处理核心之一，由称为核群的特化区域组成，分别处理不同的运动和感觉信号(3)。思维和记忆、注意力控制、情绪和行为调节、视觉或听觉信息处理、睡眠等基本功能都依赖于丘脑。因此，神经科学家们迫切希望深入表征和了解这个大脑部位。
不列颠哥伦比亚大学的一个研究团队采用一种单细胞和空间整合方法来绘制小鼠丘脑的细胞和分子图谱，这项研究成果发表在《CellReports》杂志上(4)。他们的目标是更好地了解丘脑各个亚区（核群）的独特功能如何由特定的神经元细胞类型及其相对空间结构来驱动。
首先，他们在小鼠脑组织上使用scRNA-seq和Visium空间转录组学分析，以建立空间背景下丘脑前核（ATN）内各个细胞类型的广泛图谱。他们将全转录组单细胞数据与空间数据相互关联，以确定细胞类型分配及形态背景下的标志物基因表达（图3），并为特定神经元亚型内的基因表达特征本体提供了信息。
值得注意的是，单细胞聚类与组成ATN的三个亚区相对应：前背侧核（AD）、前内侧核（AM）和前腹侧核（AV）。Visium空间转录组学数据的整合揭示了一张更全面的ATN内细胞异质性图像，并区分了与ATN外侧的丘脑核群相对应的细胞簇（图4）。在重新聚类与AV核群对应的单细胞数据（两个亚簇之间存在分级的基因表达异质性（图5）），并与空间转录组学数据重新整合后，研究团队注意到空间模式的数据表明AV细胞类型身份沿着背内侧-腹外侧轴逐渐改变。
图3
空间转录组学（ST）与scRNA-seq整合捕捉到更大范围丘脑内的不同ATN核群。
(A)用于ST的代表性大脑切片。灰色点表示与用于分析的ATN相对应的数据点，其中NeuN和DAPI分别用绿色和蓝色标记。小图提供了ATN对应数据点的UMAP嵌入。
(B,C)所有ATN数据点的UMAP降维和聚类，着色代表细胞簇身份，然后是各数据点在代表性切片上的空间位置。
(D)基于scRNA-seq数据的UMAP维度和聚类。
(E-H)根据scRNA-seq数据预测的各个细胞簇的空间位置，每个数据点表示位置可能性（基于与ST数据的一致性）。
(I-K)细胞簇特异性的标志物在ST数据集中的表达。
图片改编自Kapustinaetal.2024中的图2。(CCBY4.0).
图4
单细胞RNA测序和空间转录组学数据整合后的UMAP视图。
(L)scRNA-seq和ST数据集整合后的UMAP和细胞簇身份。
(M)与(L)相同，但根据原始（未整合）数据集的细胞簇身份对各点进行着色。
(N)与(L)相同，但根据整合分析后获得的细胞簇身份对各点进行着色，并与通过ST数据集推断出的空间位置相叠加。
小图提供了scRNA-seq细胞（金色）和ST数据点（紫色）的数量。
图5
AV内空间分级的多模态异质性。
(A)scRNA-seqAV细胞簇的UMAP和亚簇。
(B)对(A)的scRNA-seqAV亚簇进行基于VisiumST的空间位置预测。
右侧小图展示了高亮显示的AV在更大范围丘脑内的位置，其中白色数据点对应于ST中的AV细胞簇。
图片改编自Kapustinaetal.2024中的图5。(CCBY4.0).
为了以更高的分辨率评估ATN的空间结构，并分辨更多的细胞异质性，他们转向Xenium原位分析，使用了标准的247个探针的基因组合外加50个探针的定制组合，以靶向ATN的特定核群。他们从7张小鼠ATN组织切片中获得了384,076个细胞，其中有4,476个推定的兴奋性神经元（带有细胞体）位于ATN内。基于单细胞空间转录组学数据的过程聚类（图6）发现，三个细胞簇对应于根据scRNA-seq数据鉴定出的细胞簇，并反映了组成ATN的三个亚区（AD、AM和AV）。
接下来，研究团队以更精细的分辨率分析了Xenium数据集（图6），在AD、AM和AV亚区内进一步区分了细胞亚簇。值得注意的是，这项分析揭示了一种分布在整个AV内的细胞亚型，它同时表达星形胶质细胞和兴奋性神经元的标志基因，也许代表了这个ATN区域特有的混合细胞。研究团队还证实了沿着背内侧-腹外侧轴的分级基因表达异质性，这在整合scRNA-seq和Visium数据时也观察到。
图6
ATN内所有核群的空间模式异质性。
(A)用于Xenium单细胞空间转录组学（scST）的代表性大脑切片。灰色点表示与用于分析的ATN相对应的数据点，蓝色点表示未纳入分析的其他细胞。小图提供了ATN对应数据点的UMAP嵌入。
(B)所有ATN细胞的UMAP降维和聚类，着色代表细胞簇身份。
(C)各数据点在代表性切片上的空间位置。
(F)更精细分辨率下的聚类，映射到空间位置(G)。
图片改编自Kapustinaetal.2024中的图6。(CCBY4.0).
单细胞、Visium和Xenium技术的综合运用最终凸显了它们的共同价值——理清并完善复杂组织系统中的细胞异质性，并绘制与空间相关的基因表达变化，揭开细胞身份、位置和功能之间的相互作用。这些有关ATN的见解也许能够帮助研究人员更深入地了解丘脑各种信息处理功能背后的细胞和分子机制。
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参考资源：
1.HagaY,etal.Whole-genomesequencingrevealsthemolecularimplicationsofthestepwiseprogressionoflungadenocarcinoma.NatCommun14:8375(2023).doi:10.1038/s41467-023-43732-y
2.SuzukiY.High-resolutionanalysisoflungcancersrevealsheterogeneityintumormicroenvironments.10xGenomicsWebinar(2023).https://www.10xgenomics.com/videos/kx615e0tof?autoplay=true
3.https://my.clevelandclinic.org/health/body/22652-thalamus
4.KapustinaM,etal.Thecell-type-specificspatialorganizationoftheanteriorthalamicnucleiofthemousebrain.CellRep43:113842(2024).doi:10.1016/j.celrep.2024.113842
