全基因组文库筛选发现是卵巢癌转移的关键驱动因素

致死性癌症转移的发展取决于癌细胞与肿瘤微环境之间的动态相互作用，两者都可嵌入细胞外基质（ECM）中。细胞与ECM脱离接触而诱导的一种特殊程序化细胞死亡形式（也称失巢凋亡）是转移级联中的关键步骤。因此，需要进行更深入和系统的分析来确定抗失巢凋亡的关键驱动因素。

2022年1月15日，上海交通大学医学院附属瑞金医院妇产科冯炜炜团队在JournalofExperimentalandClinicalCancerResearch上发表了题为“Genome-wideCRISPR/Cas9libraryscreenidentifiesPCMT1asacriticaldriverofovariancancermetastasis”的研究论文。在本研究中，团队通过系统识别抗失巢凋亡的驱动因素，揭示了蛋白-L-异天冬氨酸（D-天冬氨酸）O-甲基转移酶（PCMT1）对粘着斑（FA）动力学以及癌症转移的贡献，研究表明PCMT1可能成为转移性卵巢癌的治疗靶点。

肿瘤转移是一个多步骤、高度选择性的过程，在此过程中，肿瘤细胞处于动态状态，并且容易因ECM的分离而发生失巢凋亡。从原发部位脱落的卵巢癌细胞能够在体内单个细胞或腹水中游离团块中存活，这可能就是抗失巢凋亡的结果。

除了肿瘤间质细胞外，肿瘤细胞还分泌大量ECM成分，主要是胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、肌腱蛋白C和骨膜蛋白，它们在转移性肿瘤中高度表达，有助于建立肿瘤转移生态位。除了众所周知的结构支架功能外，ECM成分还位于细胞之间，并介导细胞间相互作用。ECM在肿瘤转移进展中的作用，尤其是沉积、翻译后修饰和重组以及与癌细胞表面受体的动态相互作用，都受到生物化学和机械信号的严格调控。

为了鉴定抗失巢凋亡和癌症进展所需的可能的治疗靶点蛋白，团队在超低附着条件下，在卵巢癌细胞中进行了全基因组CRISPR/cas9基因敲除筛选，以模拟癌细胞从原始附着点脱落的情况。结果发现PCMT1基因与卵巢癌的抗失巢凋亡最高度相关。

在此项研究中，团队将PCMT1鉴定为蛋白质修复中的一种关键酶，是癌症抗失巢凋亡的关键驱动因素。重要的是，团队首先将PCMT1与ECM蛋白LAMB3联系起来，并证明PCMT1-LAMB3相互作用可激活整合素-FAK-Src信号通路，进而促进癌细胞粘附、迁移和侵袭，并且这些作用可通过PCMT1阻断抗体治疗来逆转。此外，PCMT1过表达增强了异种移植小鼠模型的腹水形成和远处转移，而敲除PCMT1的效果则相反。在人类卵巢癌标本中，与原发肿瘤相比，转移瘤中PCMT1的表达显著增加。临床上，与早期原发性肿瘤样本相比，PCMT1在晚期转移性肿瘤样本中高度表达。

1.在卵巢癌细胞转移模型中进行全基因组sgRNA文库的筛选

Fig.1Apooledgenome-wideCRISPRscreeninanovariancancercellmetastasismodel

人GeCKOv2CRISPR文库包含123,411个独特的sgRNAs，靶向19,050个蛋白编码基因，团队通过转导SKOV3细胞（MOI=0.3）并用嘌呤霉素筛选，产生突变的卵巢癌细胞池。然后，将SKOV3-GeCKO细胞池在正常的单层培养或超低附着（ULA）板中培养5天，以实现阴性和阳性筛选。作者假设，敲除失巢凋亡抗性驱动基因将使卵巢癌细胞对分离诱导的细胞死亡敏感，而这些细胞将不能形成球状体。此外，作者假设在ULA培养条件下，携带靶向失巢凋亡抗性基因的sgRNA的细胞将被负选择，其相应的sgRNA将在文库中被耗尽。从5×10^7细胞中获得基因组DNA，通过PCR从基因组DNA中扩增出整合的sgRNA片段，并进行大规模平行的Illumina测序（图1A）。根据FC值和每个sgRNA的数量，显示了FC大于2和sgRNA数量大于3的基因，作者从阴性筛选中鉴定出286个基因，从阳性筛选中鉴定出122个基因。使用RNAi基因富集排序（RIGER）统计算法，通过针对同一基因的多个sgRNAs之间的一致富集，对筛选结果进行排序。与单层培养的对照细胞相比，在ULA培养的细胞中，作者鉴定了一个针对1238个基因的sgrna子集，它们在ULA培养的细胞中显著缺失（Z评分>1.4），表明这些基因可能与失巢凋亡抗性和球体形成有关（图1B）。

在前几的候选基因中，选择KCTD10、ACTR10、RIF1、TECB1、PCMT1、RBM8A、PSMD14、FAM32A来对原发性卵巢癌和转移性肿瘤组织的mRNA水平进行临床验证。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR），作者发现，与相应的原发性浆液性卵巢癌相比，转移性肿瘤组织中KCTD10、PCMT1和ACTR10的mRNA水平显著升高。接下来，作者增加了样本量来验证卵巢癌中基因的表达。结果显示，与相应的原发性浆液性卵巢癌相比，10对患者的转移性肿瘤组织中PCMT1的mRNA水平升高(图1C)。为了确定PCMT1在上皮性卵巢癌（EOC）进展中的意义，作者通过IHC分析比较了PCMT1在72个原发性肿瘤组织和26个转移性肿瘤组织中的表达。配对的原发性和转移性肿瘤的代表性图像如图1D所示。转移性肿瘤中细胞质和细胞核中PCMT1的表达明显高于原发性肿瘤（图1D）。作者还发现PCMT1的表达与血清CA125的表达相关，而CA125是卵巢癌进展的生物标志物（图1E）。此外，作者对来自癌症基因组图谱（TCGA）数据集的PCMT1mRNA表达数据进行了Kaplan-Meier生存分析。EOC患者中PCMT1mRNA高表达与低总生存率（OS）（n=1656，低表达984；高表达672，P=5.3e-05)和无进展生存率（PFS）（n=1435，低表达874；高表达561，P=4.3e-05)相关（图1F）。此外，作者发现PCMT1高表达提示侵袭性乳腺（p=2e-04）、肺鳞状细胞癌（p=0.035）和肝癌（p=0.0031）预后不良，如TCGA数据集的Kaplan-Meier生存曲线（图1G），这进一步表明PCMT1可能在癌症进展中发挥重要作用。

2.PCMT1在体外对细胞的粘附、侵袭和迁移至关重要

Fig.2PCMT1contributestometastasis-associatedtumorcellphenotypes.

在PCMT1敲除和敲低条件下，均检测了PCMT1缺失对EOC细胞侵袭性的影响。作者在SKOV3细胞系中敲除了PCMT1，并进行蛋白印迹和基因组DNA测序来验证PCMT1敲除（图2A）。通过CCK-8检测，作者观察到PCMT1敲除后细胞增殖减少（图2B）。与对照组细胞相比，在ULA条件下，具有PCMT1缺陷的细胞在球状体形成过程中的活力明显下降（图2C）。

癌细胞产生失巢凋亡抗性，全基因组文库筛选发现是卵巢癌转移的关键驱动因素促进其侵袭到其他部位进行远处转移。作者已经证明了PCMT1参与了失巢凋亡抗性，它是否也能影响卵巢癌细胞的迁移、粘附和侵袭？通过划痕实验来评估细胞的群体迁移能力。为了消除细胞增殖的影响，细胞在划伤后在血清饥饿条件下培养。作者发现，敲除PCMT1削弱了细胞的迁移，体现在伤口愈合距离减少（图2D）。为了评价PCMT1对卵巢癌细胞粘附行为的影响，作者采用涂有层粘连蛋白/纤维连接蛋白（FN）的平板进行粘附试验。结果显示，当PCMT1表达缺失时，细胞粘附明显降低(图2E)。一致地，transwell实验显示，敲除PCMT1可以抑制体外细胞侵袭（图2F）。接下来，作者在OVCAR3细胞中用siRNA敲低PCMT1，并进行了细胞球体形成实验。通过western印迹和qRT-PCR证实，PCMT1沉默显著降低了PCMT1的表达。作者观察到，当PCMT1被敲低时，细胞球体的形成能力下降，球体更小，分布更松散。此外，活细胞计数显示，在5天的球形形成实验中，PCMT1基因敲低后，活细胞数量减少（图2G）。接下来，作者分析了在超低培养条件下的促凋亡-抗凋亡蛋白的行为。在SKOV3和OVCAR3细胞中，PCMT1的沉默诱导了细胞凋亡，这表明caspase-3及其底物PARP-1的裂解增加。但在相同条件下，Bcl-2和Bax水平没有明显变化，说明细胞在超低条件下培养72h时，内在凋亡通路未被激活（图2H）。在PCMT1敲除的SKOV3细胞中也发现了类似的结果。与这些缺陷相一致，在宫颈癌Hela细胞中敲低PCMT1抑制了细胞迁移和细胞粘附。这些结果表明PCMT1在多种妇科癌细胞系中具有促侵袭作用。

为了进一步研究PCMT1在卵巢癌中的作用，作者分别用空载体（对照）或PCMT1-HA转染PCMT1-KO细胞进行拯救实验。在PCMT1-KO细胞中，PCMT1的重新表达能够显著增加伤口闭合过程中细胞的迁移速度(图2I)，细胞粘附(图2J)、细胞侵袭性（图2K）和细胞增殖。综上所述，PCMT1敲除抑制了体外卵巢癌细胞的转移相关特征，而PCMT1在PCMT1-KO细胞中的重新表达挽救了该表型。

Fig.3PCMT1iscriticalforcelladhesion,invasionandmigrationinvitro.

通过在SKOV3和OVCAR3细胞中生成稳定的PCMT1-HA转染细胞，进一步检测PCMT1对EOCs粘附和迁移能力的影响(图3A)。通过观察EGFP标记的PCMT1或内源性PCMT1的免疫荧光染色，作者发现PCMT1位于细胞质和细胞核中(图3B)。当细胞在单层条件下培养时，CCK-8实验表明，过表达PCMT1对SKOV3和OVCAR3细胞活力没有影响(图3C)。然而，当这些细胞被放置在一个分离的环境中时，与对照组相比，过表达PCMT1（PCMT1-OE）的OVCAR3细胞的球形形成增强，细胞活力增加（图3D），这表明PCMT1的存在抵消了失巢凋亡。此外，通过伤口愈合实验发现，作者发现PCMT1表达的上调显著促进了细胞迁移（图3E）。此外，作者还采用粘附法检测PCMT1对力矩附着的作用。结果显示，高水平的PCMT1增强了细胞粘附，表明从PCMT1高表达的初始肿瘤中逃逸出来的细胞可以迅速附着到其他部位，从而发生植入转移(图3F)。综上所述，作者的实验表明，PCMT1的表达对于维持卵巢癌细胞的体外转移特性至关重要。

以上结果表明，PCMT1在失巢凋亡抗性中起着重要作用，因此，作者确定了在细胞脱离过程中PCMT1的表达是否会发生变化。作者发现，在ULA培养条件下培养24h后，PCMT1的表达量增加，然后在ULA培养3天后下降到基础水平（图3G）。这表明PCMT1在肿瘤细胞从原发部位脱落的过程中发挥了重要作用。综上所述，CRISPR筛选、临床标本分析和PCMT1敲除/敲除验证发现，PCMT1对卵巢癌的失巢凋亡抗性至关重要。

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作者：海星生物

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